多種工業廢水及市政污水都同時含有碳、氮和硫系化合物.含氮化合物具有毒性和臭味，而且能夠引起水體的富營養化.基于目前的生物處理技術，銨鹽通常在好氧條件下被氧化為硝酸鹽，然后硝酸鹽在厭氧條件下通過反硝化作用被還原成氮氣.自然界多種異養微生物都能夠利用各種有機物作為碳源和能源進行反硝化作用.它們具有豐富的生物多樣性，通常屬于變形菌門中不同的屬，例如：Rhodoferax、Dechloromonas和Sulfuritalea.

　　硫化物具有強烈的毒性和臭味，它的超標排放是目前面臨的嚴峻的環境問題之一.它能夠和細胞色素中的金屬離子進行反應，進而抑制細胞的呼吸作用.此外，它還具有腐蝕性并產生很高的化學需氧量(chemical oxygen demand，COD).硫化物通常在產甲烷的過程中伴隨產生，它也產生于多種工業加工過程，例如：石油化工、造紙、制革等.許多物理、化學和電化學方法已經用來處理氣體和水中的硫化物，例如：沉淀法、氣提、離子交換、電催化氧化、有機溶劑和化學氧化.其中，利用無色硫細菌的生物處理技術具有低成本、低能耗和產物無害等優勢.因此，它是一種國際上日益關注的熱門技術.Thiobacillus denitrificans被發現能夠利用無機硫化合物作為能量來源，無機碳化合物作為碳源進行生長.左劍惡等在升流式生物膜反應器中，利用無色硫細菌處理廢水中的硫化物，去除率為90%，單質硫轉化率為100%.這類能夠利用無機硫化合物的自養反硝化細菌具有較高的研究價值，因為它在反硝化過程中不需要再額外添加有機碳源并節約經濟成本.相關技術目前已經得到廣泛的應用，例如：市政污水、地表水和垃圾滲濾液的處理.

　　近年來，多單元聯合生物技術快速發展并應用于處理含有碳、氮和硫系化合物的廢水.此技術的過程原理為：厭氧發酵階段硫酸鹽還原所產生的硫化物及少量剩余COD在反硝化單元被來自硝化單元的硝酸鹽氧化去除.在香港特別行政區，應用此技術已經成功建立了示范工程，主要進行沿海地區高硫酸鹽生活污水的脫氮處理.脫氮單元中的活性污泥通常含有自養和異養反硝化細菌，其中有些物種能夠利用含硫化合物還原硝化單元所產生的硝酸鹽.除能以含硫化合物作為能源的自養反硝化細菌以外，一些異養細菌也被發現具有這樣的功能.它們能夠利用硫化物和硝酸鹽進行呼吸作用，并產生單質硫和氮氣作為反應產物.這種生物基單質硫具有親水的特性，能夠作為生產肥料和殺蟲劑的原料，具有較高經濟價值.

　　本研究分離1株能夠利用硝酸鹽作為電子受體，乙酸鹽和硫化物作為電子供體進行生長代謝的細菌.在硫化物氧化過程中，單質硫為主要的反應產物.已有的研究結果顯示Thauera屬的物種是污水處理系統中最活躍的反硝化細菌，但是其硫氧化的生理特性極少有研究報道.本研究揭示菌株HDD1在生態學以及污水處理技術應用中的重要意義.

　　1 材料與方法1.1 菌株分離與培養條件

　　活性污泥來源于實驗室運行的污水處理生物反應器.分離培養基包括以下物質(g·L-1)：Na2S·9H2O，1.5;CH3COONa，0.387 5;KNO3，0.757 5;NH4Cl，1.0;KH2PO4，1.8;Na2HPO4·12H2O，3.0;MgSO4·7H2O，0.1;Agar，1.5.培養基滅菌后加入過濾滅菌的微量元素液.采用亨蓋特厭氧培養技術結合稀釋滅絕法進行菌株的分離和純化.活性污泥經過梯度稀釋以后，接種到含有固體培養基的厭氧管中.在30℃條件下靜置培養7 d后，單克隆被接種到液體培養基中進行培養.液體培養基經過煮沸和充入氬氣達到厭氧條件，加入L-半胱氨酸(0.5 g·L-1)和1 mL濃度為0.2%的刃天青作為除氧劑和指示劑.通過在固-液分離培養基中反復轉接得到細菌培養物.通過顯微鏡觀察和16S rRNA基因測序技術檢測其是否為純培養.

　　1.2 菌株鑒定

　　采用Bacterial DNA Mini Kit (TianGen，中國)提取細菌基因組DNA.提取的基因組DNA經分光光度計(Nanodrop 2000，Thermo，美國)定量后作為聚合酶鏈式反應的模板.采用細菌16S rRNA基因通用引物F27(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和R1492(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進行擴增反應.反應體系(50 μL)包括Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix (25 μL)(NEB，美國)，濃度為20 μmol·L-1的上下游引物(2 μL)，20 ng DNA模板(1 μL)和蒸餾水(22 μL).采用GeneAmp PCR system (9700，ABI，美國)進行擴增反應，具體步驟設置如下：94℃起始變性3 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環.擴增產物經測序后，用BLAST-N程序和原核生物數據庫進行比對分析.利用MEGA 5.0軟件包，采用鄰位相連算法構建系統進化樹.進化樹的拓撲結構經過1 000次引導重復取樣檢驗.

　　1.3 生理學和化學分析

　　細菌經離心收集后，用磷酸鹽緩沖液清洗3次，用2.5%戊二醛固定30min.用30%、50%、70%、90%、100%的乙醇脫水后，以飽和叔丁醇做介質進行真空干燥.利用掃描電子顯微鏡(Quanta 200 FEG，FEI，美國)觀察細胞形態.利用生化試劑條(API 20NE，BioMérieux，法國)檢測菌株的生理特征.細胞經過標準革蘭氏染色后，用氫氧化鉀消散法復檢[25].菌體蛋白濃度測定采用Bradford Protein Assay Kit (Takara，日本)的標準方法.CH3COO-、NO3-、NO2-、SO42-和S2O32-的濃度由離子色譜(ICS-90A，DIONEX，美國)測定.S2-的測定采用標準亞甲基藍分光光度法.利用能量散射譜儀(EDAX，美國)測定單質硫及其含量.菌株的16S rRNA基因序列的GenBank登錄號為KX242545.

　　2 結果與分析2.1 菌株的分離與鑒定

　　經過5輪固-液分離培養基轉接，得到菌株HDD1.在顯微鏡視野下，細菌的形態呈統一的桿狀;16S rRNA基因測序結果中不存在噪聲信號，這表明菌株HDD1為純培養.提交長度為1 397bp的16S rRNA基因序列到數據庫進行比對分析，結果顯示HDD1與Thauera aminoaromatica S2的相似度最高，達到98.7%.進化樹結果顯示HDD1在Thauera屬中形成一個單源的進化枝，并與Thauera humireducens和Thauera terpenica形成一個進化群(圖 1).用最大似然算法對系統進化樹驗證，得到相同結果.這些結果表明菌株HDD1可能是Thauera屬的一個新種，但是還需多相分類結果進行驗證.

圖 1 鄰位相連法構建16S rRNA基因系統進化樹

　　2.2 菌株的生理特性

　　菌株HDD1革蘭氏染色呈陰性，細胞呈桿狀(圖 2).反硝化作用、吲哚反應和有機酸同化作用呈陽性;糖類水解酸化反應呈陰性(表 1).通常Thauera屬的各個種是一類兼性厭氧，專性進行呼吸作用的細菌.它們能夠利用氧氣、氮氧化物作為電子受體，在好氧呼吸和反硝化作用之間轉化代謝狀態.有些種在厭氧條件下可以還原硒酸鹽.很多種能夠利用有機酸、氨基酸、芳香和脂肪類化合物進行生長.它們通常在污水處理廠、江河、池塘沉積物等被污染的地區被發現.菌株HDD1的生理特征結果和伯杰氏系統微生物學手冊中Thauera屬的描述相同.

圖 2 菌株HDD1掃描電子顯微鏡圖像

　　表 1 菌株HDD1的生理學特性

　　2.3 菌株的代謝特性

　　菌株HDD1在厭氧條件下利用硝酸鹽作為電子受體氧化乙酸鹽和硫化物.在15 h之內，CH3COO-基本被完全代謝，其濃度由300 mg·L-1下降到20 mg·L-1，菌體蛋白濃度由1.5 μg·mL-1上升到11 μg·mL-1[圖 3(a)]，生物量有所增加;NO3-濃度由487 mg·L-1下降到38 mg·L-1，NO2-在第15~20 h之間有短暫的積累，最高濃度為67.7 mg·L-1 [圖 3(b)];濃度為200 mg·L-1的S2-被完全代謝，S2O32-(18.4~36.2 mg·L-1)和SO42-(85.5~127.8 mg·L-1)的濃度略有上升[圖 3(c)].S2O32-和SO42-的背景值可能是由于在滅菌過程中發生輕微的氧化導致的.在0~5 h，CH3COO-濃度快速地由300 mg·L-1下降到128 mg·L-1，菌體蛋白濃度由1.5 μg·mL-1上升到5.7 μg·mL-1.在代謝反應初期，活化細菌直接進入對數生長期，生物量快速增加，CH3COO-濃度相應地快速下降.在此階段，NO3-(487~283 mg·L-1)作為電子受體并沒有相應地大幅減少.這是由于在對數生長期，大部分CH3COO-通過同化作用直接合成細胞物質，只有少部分通過與NO3-耦合進行呼吸作用.進入穩定期和衰亡期后，細菌同化作用速率減小，需要產生大量能量維持細胞的生命活動.CH3COO-和S2-作為電子供體耦合NO3-進行呼吸作用，大部分NO3-(283~38 mg·L-1)被代謝消耗.為了限制S2-過度氧化成S2O32-和SO42-，增加單質硫的產量，電子受體NO3-濃度(487 mg·L-1)的初始設置較低.它也是工藝實際運行過程中一個重要的參數，根據進水COD含量和活性污泥狀態而進行調整.隨著硫化物被逐漸氧化，所形成的單質硫逐漸聚集成為直徑不同的顆粒[圖 4(a)].這些顆粒主要是由C、O、S和P等元素組成.其中S元素占總含量的20%;由于樣品中存在菌體等有機物，C元素占總量的68.6%;由于培養基中存在磷酸鹽等物質，O元素和P元素分別占總含量的9.2%和2.1%[圖 4(b)].由于S2O32-和SO42-含量很低，根據化學反應元素平衡原理，硫化物氧化的主要產物為單質硫.硫酸鹽被還原成硫化物，硫化物再被氧化，是硫元素生物地球化學循環中重要的過程.這個過程涉及到多種復雜的反應、硫細菌和酶.無色硫細菌分為4個系統進化世系，3個屬于細菌域，1個屬于古細菌域.多數的無色硫細菌屬于Proteobacteria門的Gammaproteobacteria綱.根據碳源和能量代謝方式，無色硫細菌可以分為不同的生理類型，包括：專性化能無機營養型、兼性化能無機營養型、化能無機異養型和化能有機異養型.化能無機異養型是指能夠利用還原性含硫化合物作為能量來源，但是不能固定二氧化碳的細菌.根據生理學特性，菌株HDD1不能利用光能，且只能利用乙酸鹽等有機物作為碳源，所以它屬于化能異養型微生物.在氧化硫化物過程中其是否獲得能量還需進一步驗證.原位檢測技術結果顯示Thauera屬在污水處理系統中是一類活躍的反硝化細菌，但是很少有研究報道它們的硫氧化功能.微生物群落分析表明Thauera屬在反應器的生態系統中具有很高的豐度，但是由于缺乏菌株的純培養，深入的生理學特征研究很難開展.在生理學研究中，菌株HDD1可以作為研究Thauera屬硫氧化功能的模式種為進一步的研究提供基礎;在生態學研究中，它的相關功能基因可以作為分子標記，為搜索復雜群落中的功能微生物提供技術支撐.目前，造紙廠、煤氣廠和制藥廠等工業廢水都含有大量的硫化物.生物法短程氧化硫化物并回收單質硫作為資源具備很多優勢.首先，它是化學和化肥工業的原料.其次，和物理化學法相比，生物法更加節約能源和成本.分離并研究功能菌株的生理學特性是這項生物技術應用的重要保障.在這項技術中，菌株HDD1和其他常見的硫氧化細菌，例如：Thiobacillus denitrificans和Paracoccus denitrificans起到關鍵作用并有待更深入地研究.　

圖 3 菌株HDD1的碳氮硫化合物代謝

(a)掃描電子顯微鏡圖像;(b)能量色散譜分析圖 4 菌株HDD1代謝產物分析

　　3 結論

　　在本研究中，從反應器活性污泥中分離純化出1株細菌HDD1.基于16S rRNA基因的系統進化分析顯示，它與Thauera屬的物種具有親緣關系并形成一個單源的進化枝.生理特征實驗結果驗證表明菌株HDD1是Thauera屬的一個種.菌株HDD1能夠利用硝酸鹽作為電子受體同步氧化硫化物和乙酸鹽.在15 h之內，濃度為300 mg·L-1的CH3COO-、200 mg·L-1的S2-和487 mg·L-1的NO3-被完全代謝去除.根據其特殊的生理特征，菌株HDD1可以同時應用于處理含有碳、氮、硫系化合物的工業廢水及硫元素的資源化回收.

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