1 引言(Introduction)

　　石油污染對生態環境造成的危害日益嚴重, 采用物理或化學手段可有效降低石油污染, 但存在二次污染及治理成本高、條件苛刻等缺點, 生物降解法具有條件溫和、環境影響小、適應性廣等優點, 是治理石油污染有效方法之一.已報道能降解石油的微生物包括細菌、放線菌、霉菌、酵母及藻類.其中以細菌種類最多, 主要有假單胞菌屬(Pseudomonas)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、紅球菌屬(Rhodococcus)、諾卡氏菌屬(Nocardia)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium).不同環境來源微生物特性差別較大, 對石油組分降解能力及降解途徑不同, 我國大部分油田開采及運輸區冬季冰期較長、平均氣溫低, 微生物處理效果受溫度等條件影響大, 尋找耐高鹽、酸堿等極端環境微生物具有重要意義.

　　本文從我國西部石油污染土壤中篩選了一株適應性強、降解能力高的石油降解菌株, 進行了生理生化及16S rDNA序列分析, 并對菌株生長及降解特性進行研究.將該菌添加到活性污泥中, 采用SBR間歇式活性污泥法處理含油廢水效果良好，為極端環境下微生物治理石油污染及含油廢水處理提供科學依據.

　　2 材料與方法(Materials and methods)2.1 樣品及培養基

　　污染土樣取自于甘肅金川公司周邊石油污染土壤, 原油樣品來自于中石油蘭州石化公司.

　　LB培養基：蛋白胨5.0 g;酵母粉2.5 g;NaCl 5.0 g;瓊脂10.0 g;pH 7.0;蒸餾水500 mL.

　　基礎培養基：NH4NO3 3.0 g;K2HPO4 1.5 g;KH2PO4 1.5 g;NaCl 0.5 g;MgSO4·7H2O 0.1 g;FeCl2 0.01 g;CaCl2 0.01 g;pH 7.0;蒸餾水1000 mL.

　　2.2 試劑及儀器

　　Taq DNA聚合酶、dNTP、DNA Maker 2000、細菌基因組DNA提取試劑盒(均來自上海生工生物工程股份有限公司), Agarose(TaKaRa Biotechnology), 十七碳酸甲酯(西格瑪奧德里奇上海貿易有限公司), 石油醚(天津市富宇精細化工有限公司).

　　TRACE DSQ GC-MS聯用儀(美國賽默飛世爾科技有限公司), UV-2102PC紫外可見分光光度儀(尤尼柯上海儀器有限公司), Tanon-3500凝膠圖像處理系統、EPS-300電泳儀(上海天能科技有限公司), TC-96/G/H PCR擴增儀(杭州博日科技有限公司), 5B-3B(V8)水質測定儀(蘭州連華環保科技有限公司).

　　2.3 石油降解菌的篩選及鑒定

　　取10 g石油污染土樣加入100 mL無菌水中, 于30 ℃、150 r·min-1振蕩培養24 h.取上層液體2 mL, 加入到100 mL以原油為唯一碳源的基礎培養基馴化培養, 原油濃度逐級遞增為1000, 2000, 3000, 4000 mg·L-1, 每次馴化周期為3 d.取末次馴化培養液, 以10-1、10-3、10-5倍稀釋, 在LB培養基上涂板, 分離優勢菌, 于-80 ℃保藏備用.已分離菌株再轉接到原油濃度為3000 mg·L-1的基礎培養基中, 于30 ℃、150 r·min-1培養7 d, 測定石油降解率, 最后選取1株適應能力強、高效利用石油菌株JC-106.細菌形態觀察、革蘭氏染色、生理生化鑒定參照文獻進行.

　　用Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒提取細菌總DNA, 采用16S rDNA通用引物(27F：5′-AGA GTT TGA TCC TGCTC AG-3′;1492R：5′-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′)擴增目的片段, 反應循環參數如下：94 ℃預變性5 min, 94 ℃變性50 s, 58 ℃退火1 min, 72 ℃延伸2 min, 30個循環, 72 ℃延伸10 min.PCR產物送上海生工生物工程公司測序, 在NCBI基因庫中進行BLAST比對, 通過CLASTAL X和MEGA4.0軟件構建系統發育樹.

　　2.4 石油降解菌生長特性

　　菌株JC-106按1%接種量(V/V)接入LB液體培養基, 分別于5、15、25、30、35、40、45、55 ℃, 150 r·min-1振蕩培養24 h, 測定各培養液OD600 nm, 確定菌株的最適生長溫度.選擇初始pH分別為2、4、6、7、8、10、12, 鹽度分別為0%、1%、2%、3%、4%、5%, 于35 ℃、150 r·min-1條件下培養24 h, 測定各培養液的OD600 nm, 確定菌株的最適生長pH和鹽度.

　　取JC-106菌液2 mL轉接到原油濃度為3000 mg·L-1基礎培養基, 分別在15、35 ℃條件下振蕩培養, 在1、3、5、7、10、15、20 d對進行取樣涂平板計數, 計算菌株在原油培養基中生長數量.

　　2.5 石油降解率測定

　　將菌株JC-106接種于含3000 mg·L-1原油基礎培養基中, 分別于15、35 ℃, 150 r·min-1振蕩培養15 d, 試驗設3組平行、3組空白.重量法測定石油降解率, 即以石油醚為萃取溶劑, 對殘余原油進行反復萃取回收, 萃取液用干燥無水硫酸鈉過濾到燒杯中, 自然干燥并稱重.石油降解率(η)按(1)式計算：

(1)

　　式中, M1為對照組石油質量(g), M2為樣品組石油質量(g).

　　用正己烷萃取培養液中剩余原油, 過濾掉殘余菌體和雜質, 定容到100 mL容量瓶中.以十七烷碳酸甲酯作為內標物(IS), 用GC-MS對石油烷烴組分進行分析, 用內標法測定殘余石油中烷烴組分含量.GC-MS運行條件：DB-5MS毛細管柱30 m × 0.25 mm × 0.25 μm;采用程序升溫, 柱溫50 ℃, 維持3 min后以15 ℃·min-1的速率升到120 ℃, 再以8 ℃·min-1升溫速率升到260 ℃, 保持25 min.載氣氦氣, 柱流量1 mL·min-1, 分流比20:1.進樣口溫度250 ℃, 傳輸線溫度260 ℃, 進樣量1 μL, 離子源溫度250 ℃, EI源, 電離電壓70 eV;掃描范圍35~650 amu.

　　2.6 菌株在不同有機碳源中生長特性

　　將菌株JC-106接到不同濃度十二烷、二十四烷、正庚烷、正辛烷、正癸烷、環己烷、苯、甲苯、二甲苯、聯苯、鄰苯二酚、芘、萘、蒽、菲為唯一碳源的基礎培養基, 于35 ℃、150 r·min-1培養7 d, 取樣計數, 計算菌株在不同有機碳源中生長數量.

　　2.7 石油降解菌對含油廢水的處理

　　從蘭州市某污水處理廠生物曝氣池取一定量活性污泥對其進行5 d馴化培養, 按泥水比為1:3的比例, 取活性污泥2.3 L、水6.9 L加入圓柱形生物反應器中(h=80 cm、d內=14 cm、σ=0.5 cm、V有效=12.3 L).以葡萄糖(700 mg·L-1)、氯化銨(120 mg·L-1)、磷酸二氫鉀(7 mg·L-1)為進水營養物質, 進水各指標濃度為COD：656.9 mg·L-1;NH4+-N：48.74 mg·L-1;TP：1.232 mg·L-1;原油：1000 mg·L-1.室溫為26~34 ℃, 1 d運行兩個周期, 曝氣10 h, 停留2 h, 在裝置停止運行期間加營養換水.以2%(V/V)接種量接JC-106菌液于反應器中作為實驗組, 以不加JC-106菌液反應器為空白對照組.分別于1、3、5、7、10、12、15 d取樣, 測定出水COD、NH4+-N、TP、原油濃度, 計算各指標去除率.實驗組反應器中JC-106菌株進行分離、鑒定, 計算JC-106在反應器中數量.

　　3 結果(Results)3.1 石油降解菌篩選和鑒定

　　從西部石油污染土壤分離到具有高效石油降解能力的優勢菌株JC-106, 菌落呈桔紅色, 圓形不透明, 表面光滑, 邊緣規整, 細胞為球桿狀, 細菌16S rDNA與赤紅球菌(Rhodococcus rubber, NR_118602.1)序列相似性為100%, 菌株在GenBank中序列登錄號為KT247409, 在系統發育樹上與其聚類(圖 1), 初步確定JC-106為赤紅球菌(Rhodococcus rubber).

　　表 1 菌株JC-106生理生化特征　　

　　圖 1菌株JC-106的系統發育樹

　　3.2 菌株JC-106生長特性

　　把JC-106接種于LB液體培養基, 分別在不同溫度、初始pH和鹽度下培養.發現其在15～40 ℃、pH 6～8、鹽度0～4%的條件下生長良好, 菌株最適生長溫度為35 ℃, 最適pH 8, 最適鹽度為1% (圖 2A、B、C).JC-106在原油為唯一碳源的培養基生長情況如圖 2d所示, 15 ℃培養時, JC-106在最初1～3 d生長緩慢, 3 d后菌體數量明顯增長, 15 d時達最高.在35 ℃培養時, 在1 d數量明顯增加, 5 d達最高, 7 d后菌體數量開始下降.

　　圖 2菌株JC-106生長特性(a.溫度對菌株生長影響;b.初始pH對菌株生長影響;c.鹽度對菌株生長影響;d.菌株在含原油培養基中生長特征)

　　3.3 JC-106對原油降解能力及對烷烴組分利用

　　JC-106接種于原油濃度為3000 mg·L-1基礎培養基, 分別于15和35 ℃培養15 d, 對原油降解率分別為58.18%和41.61%.GC-MS分析發現原油中以直鏈烷烴為主, 包括正十四烷、十五烷、十六烷、十七烷、十九烷、二十烷、二十一烷、二十四烷、二十七烷、二十八烷、四十四烷.在35 ℃培養時, 對直鏈烷烴、植烷、姥鮫烷的降解率分別為98.16%、54.60%和85.46%, 15 ℃培養時的降解率分別為96.13%、48.61%和86.83%(圖 3).

　　圖 3菌株JC-106降解原油的GC-MS分析(a. RT=13.39為正十五烷, RT=16.18為正十七烷, RT=20.36為十七烷碳酸甲酯(內標物), RT=21.22為正二十一烷;b. RT=16.20為姥鮫烷, RT=17.59為植烷, RT=20.36為十七烷碳酸甲酯, RT=23.46為正二十七烷;c. RT=13.43為正十五烷, RT=16.23為正十七烷, RT=20.41為十七烷碳酸甲酯, RT=21.27為二十一烷;d. RT=12.85為植烷, RT=15.48為正二十烷, RT=16.25為姥鮫烷, RT=20.41為十七烷碳酸甲酯)

　　3.4 菌株JC-106對不同有機碳源的利用

　　將JC-106接于不同有機物為唯一碳源基礎培養基中, 35 ℃培養7 d, 結果如表 2所示, 菌株在十二烷、二十四烷、正辛烷中生長較好, 也能在鄰苯二酚、萘、蒽等芳香烴的培養基中生長.

　注: “-”菌落數小于對照組的2倍;“+”菌落數超過對照組2倍低于4倍;“++”菌落數高于對照組4倍低于10倍;“+++”菌落數高于對照組10倍低于20倍;“++++”：菌落數高于對照組20倍.

　　表 2 菌株JC-106在不同有機碳源中生長情況　　

　　3.5 菌株JC-106對含油廢水的處理

　　通過SBR間歇式活性污泥法, 含油廢水處理15 d后, 出水各指標濃度和去除率見圖 4, 實驗組COD、NH4+-N、TP的平均去除率分別為96.49%、96.88%、99.15%, 石油去除率為92.43%, 不加入石油降解菌的對照組去除率為53.80%.菌株JC-106在SBR生物反應器中生長情況見圖 5, JC-106在廢水中的初始濃度為2.66×109 cfu·mL-1, 在處理含油廢水1~15 d的時間內, JC-106數量維持在4.8×1010～1.0×1011 cfu·mL-1.

　　圖 4含油廢水出水指標濃度和去除率

　　圖 5菌株JC-106在含油廢水中的生長情況

　　4 討論(Discussion)

　　已報道降解石油微生物超過200多種, 不同菌株對石油組分降解效果存在差異, Quatrini等從地中海海岸線石油污染土壤篩選出一株諾卡氏菌、兩株紅球菌和兩株戈登氏菌, 其中紅球菌對C20和C28的降解率分別為54.39%和81.29%(Quatrini et al., 2008).Walter等分離的紅球菌可降解芘等多環芳烴.Soudi等從石油污染土壤分離的紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)SKO-1, 培養56 h后對濃度為1000 mg·L-1苯酚的降解率為99.64%.Johnson等分離的惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)只對C5~C10烷烴有很好降解效果.本文從我國西部石油污染土壤中分離的赤紅球菌JC-106在15 ℃培養15 d后對原油的降解率為41.61%.GC-MS分析發現原油中96.13%正構烷烴(C14~C44)被降解, 同時也能降解支鏈和復雜的植烷、姥鮫烷等.在正十二烷、正二十四烷、正辛烷及鄰苯二酚、蒽、萘等有機物中較好生長, 表明該菌能利用和分解這些化合物.

　　含油廢水通常呈高COD、高油含量、高氨氮等特點, 對其處理難度較大, 利用高效石油降解菌處理含油廢水具有廣闊應用前景.徐新陽等從石油污染土壤和含油廢水活性污泥中馴化了4株石油降解菌, 對含油廢水處理64 h后, 發現對含油廢水中COD的去除率最高達68.00%, 混合菌對含油廢水中COD的去除率明顯高于單一菌種(徐新陽等, 2007).羅群等以活性污泥為微生物菌種來源, 構建了小試反應裝置, 利用添加柴油的海水馴化高效石油降解菌, 發現柴油大部分組分得到了不同程度降解, 兩個平行反應器中柴油的降解率分別達到98.30%和98.80%(羅群等, 2010).本文自主設計SBR活性污泥處理裝置, 采用間歇式活性污泥處理方法研究了添加JC-106對高濃度含油廢水處理效果, 經15 d處理后, 出水水質中的COD、NH4+-N、TP的平均去除效率高, 對廢水中原油有顯著降解效果.菌株在含油廢水中穩定生長, 一次添加即可維持所需菌量, 且菌體數量一直維持在較高水平, 表明該菌株能適應廢水環境, 又呈現出較好原油去除能力。

　　5 結論(Conclusions)

　　1)從石油污染土壤中篩選出1株高效石油降解菌JC-106, 經細菌形態學、生理生化及16S rDNA序列分析初步鑒定為赤紅球菌(Rhodococcus rubber), 該菌具有較廣環境適應性, 在15～40 ℃、初始pH 6～8、鹽度0～4%條件下生長良好.

　　2)赤紅球菌JC-106在15和35 ℃下培養15 d對原油的降解率分別為41.61%和58.18%, 在35 ℃培養時, 對直鏈烷烴、植烷、姥鮫烷的降解率分別為98.16%、54.60%和85.46%, 15 ℃培養時的降解率分別為96.13%、48.61%和86.83%.能分解利用十二烷、二十四烷、正辛烷及鄰苯二酚、蒽、萘等芳烴.

　　3)用SBR間歇式活性污泥法, 將赤紅球菌JC-106用于含油廢水處理, 菌株在含油廢水中生長良好, 15 d后處理廢水出水的COD、NH4+-N、TP的平均去除率分別為96.49%、96.88%、99.15%, 石油去除率為92.43%, 可用于極端環境石油污染廢水處理及污染土壤生物修復.